1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。
3、将试管口通过火焰。
4、将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。
5、将试管通过火焰，并塞上棉塞。
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
8、将平板倒置放入培养箱中培养。
平板划线法一般指划线平板，通过平板划线而获得微生物纯培养物的方法，又称平板划线法。是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞，用接种环在平板表面上作多次由点到线的划线稀释而获得较多独立分布的单个细胞，并让其成长为单菌落的方法。通过反复划线分离，可获得微生物的纯种。